基因敲除株的制备过程

设计 gRNA

• 确定靶位点：根据要敲除的基因序列，选择合适的靶位点。一般选择基因的编码区，尤其是起始密码子附近或功能结构域所在区域，以确保敲除后能有效破坏基因功能。

• 设计 gRNA 序列：针对选定的靶位点，设计特异性的 gRNA 序列。gRNA 通常长度为 20 个左右的核苷酸，需与靶 DNA 序列精确互补配对，同时要避免与基因组中其他非靶区域有高度同源性，以减少脱靶效应。

构建表达载体

• 选择载体：挑选适合的表达载体，如常用的质粒载体。载体应包含能在宿主细胞中启动 gRNA 和 Cas9 蛋白表达的启动子，以及筛选标记基因，如抗生素抗性基因，以便后续筛选阳性克隆。

• 插入 gRNA 和 Cas9 基因：将合成的 gRNA 序列和 Cas9 基因片段通过基因克隆技术插入到载体中，构建成完整的 CRISPR - Cas9 表达载体。

细胞转染或转化

• 转染 / 转化方法选择：根据宿主细胞类型选择合适的方法将表达载体导入细胞。对于动物细胞，常用的方法有脂质体转染、电穿孔法等；对于细菌或酵母细胞，可采用化学转化、电转化等方法。

• 转染 / 转化操作：按照所选方法的操作规程进行实验，将 CRISPR - Cas9 表达载体导入细胞。在导入后，载体进入细胞并在细胞内表达 gRNA 和 Cas9 蛋白，gRNA 引导 Cas9 蛋白识别并结合到靶基因位点。

筛选阳性克隆

• 初步筛选：利用载体上的筛选标记基因进行初步筛选。例如，使用含有相应抗生素的培养基培养细胞，只有成功导入表达载体并表达出抗性蛋白的细胞才能存活，从而得到初步筛选的阳性细胞克隆。

• 鉴定阳性克隆：通过 PCR 扩增靶基因区域，然后进行测序分析，确定是否在靶位点发生了基因编辑。只有在靶位点出现碱基缺失、插入或替换等突变，导致基因功能丧失的克隆，才是真正的基因敲除阳性克隆。

  
  

  
  

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单克隆培养与鉴定

• 单克隆分离：采用有限稀释法或软琼脂平板法等，将筛选出的阳性细胞克隆进行单细胞分离培养，得到单个细胞衍生的克隆群体，确保每个克隆均来自单个基因敲除细胞。

• 进一步鉴定：对单克隆细胞进行再次鉴定，除了通过测序验证基因敲除情况外，还可采用 Western blot、免疫荧光等方法检测基因敲除后蛋白表达水平的变化，以确认基因敲除的效果。

动物模型制备（如需要）

• 胚胎注射：如果要制备基因敲除动物模型，如小鼠，可将 CRISPR - Cas9 系统注射到受精卵中。通过显微操作技术，将含有 gRNA 和 Cas9 蛋白或 mRNA 的溶液注射到受精卵的原核或细胞质中，然后将注射后的受精卵移植到代孕母鼠的输卵管中，让其发育成胚胎。

• 基因敲除动物鉴定：待幼鼠出生后，通过提取鼠尾基因组 DNA，采用 PCR 和测序等方法鉴定基因敲除情况，筛选出基因敲除阳性的动物个体，即得到基因敲除株动物模型。

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