荧光检测PCR定量检测原理及优点

荧光检测 PCR 定量检测，即实时荧光定量 PCR（qPCR），其原理是在普通 PCR 的基础上，加入荧光基团，通过对 PCR 过程中荧光信号的实时监测，实现对核酸模板的定量分析，具体如下：

荧光信号产生机制

荧光染料法：常用的荧光染料如 SYBR Green I，它可以特异性地结合到双链 DNA 的小沟部位。在 PCR 反应体系中，当 DNA 进行复制形成双链时，SYBR Green I 就会结合到双链 DNA 上，从而被激发产生荧光信号。而且荧光信号的强度与双链 DNA 的含量成正比关系。

探针法：使用的是 TaqMan 探针等。TaqMan 探针是一段与目标 DNA 序列特异性互补的寡核苷酸，其 5' 端标记有荧光报告基团（如 FAM），3' 端标记有荧光淬灭基团（如 TAMRA）。在 PCR 反应过程中，当引物延伸到探针结合部位时，Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性会将探针降解，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。每扩增一条 DNA 链，就会有一个探针被切断，释放出一个荧光信号。

定量原理

标准曲线法：通过一系列已知浓度的标准品模板进行 PCR 扩增，得到不同浓度标准品对应的荧光信号值，以标准品的起始拷贝数的对数为横坐标，以对应的荧光阈值循环数（Ct 值）为纵坐标，绘制出标准曲线。在相同条件下对未知样品进行 PCR 扩增，根据其得到的 Ct 值，从标准曲线上就可以计算出未知样品的起始拷贝数。

Ct 值的定义与应用：Ct 值是指在 PCR 扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。研究表明，在 PCR 反应的指数增长期，Ct 值与起始模板量的对数呈线性关系，即起始模板量越多，Ct 值越小；反之，起始模板量越少，Ct 值越大。因此，可以利用 Ct 值来对模板进行定量分析。

荧光检测 PCR 定量，即实时荧光定量 PCR（qPCR），具有以下优点：

灵敏度高：能够检测到极低拷贝数的核酸模板，可对痕量核酸进行定量分析，比如在病毒感染早期，血液中病毒核酸含量极低时，也能准确检测出病毒的存在并进行定量，有助于疾病的早期诊断。

特异性强：无论是使用荧光染料法还是探针法，都具有很高的特异性。探针法中，TaqMan 探针与目标 DNA 序列特异性互补结合，只有当引物和探针都与目标序列准确结合时才能产生荧光信号，极大地提高了检测的特异性；荧光染料法中，SYBR Green I 只结合双链 DNA，且在 PCR 引物设计时会确保其与目标序列特异性结合，从而保证了检测的特异性。

精确性好：通过对荧光信号的实时监测和对 Ct 值的精确测定，以及标准曲线的建立，能够实现对核酸模板的准确定量。实验结果的重复性好，变异系数通常较低，在科研和临床诊断等领域能够提供可靠的数据。

快速高效：整个 PCR 过程在封闭的反应体系中进行，无需像传统 PCR 那样在反应结束后进行开盖检测，减少了操作步骤和时间，同时也降低了污染的风险。一般在 1 - 2 小时内就能完成检测，能够快速得到检测结果，适用于紧急情况和大规模样本的检测。

高通量：可以同时对多个样本进行检测，配合自动化的仪器设备，能够实现一次运行检测几十甚至上百个样本，大大提高了检测效率，适用于大规模的疾病筛查、基因表达分析等研究和应用。

实时监测：在 PCR 扩增过程中实时监测荧光信号的变化，能够直接观察到核酸扩增的动态过程，了解反应的进程和效率，及时发现异常情况，如引物二聚体的形成、非特异性扩增等，有助于对实验结果进行准确的分析和判断。