肿瘤细胞如何培养

肿瘤细胞培养是指从肿瘤组织中分离出肿瘤细胞，在体外模拟体内环境使其生长、增殖的技术。以下是肿瘤细胞培养的基本方法：

培养前准备

实验器材：准备细胞培养瓶、培养皿、移液管、离心管、显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台等。所有器材需经过严格的清洗、消毒和灭菌处理，以防止微生物污染。

培养基：根据肿瘤细胞的类型选择合适的培养基，如 RPMI - 1640、DMEM 等。培养基中通常需添加 10% - 20% 的胎牛血清，以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子。此外，还需加入青霉素、链霉素等抗生素，以防止细菌污染，其终浓度一般为青霉素 100 U/mL、链霉素 100 μg/mL。

消化液：常用的消化液为胰蛋白酶 - EDTA 混合液。一般胰蛋白酶的浓度为 0.25%，EDTA 的浓度为 0.02%。

细胞取材与分离

取材：在无菌条件下，从手术切除的肿瘤组织中获取标本。尽量选取肿瘤边缘生长活跃的部分，避免取到坏死灶。将取下的组织放入含有预冷的、含抗生素的 PBS 缓冲液的无菌容器中，尽快送往实验室进行处理。

分离：将肿瘤组织在超净工作台上用 PBS 缓冲液冲洗数次，去除血液和杂质。然后将组织剪成 1 - 2 mm³ 的小块，加入适量的消化液，在 37℃恒温箱中消化 15 - 30 分钟，期间轻轻摇晃容器，使组织块与消化液充分接触。当组织块变得松散，大部分细胞解离下来时，加入含有血清的培养基终止消化。通过滤网过滤细胞悬液，去除未消化的组织块，然后将细胞悬液离心，转速一般为 1000 - 1500 rpm，离心 5 - 10 分钟，弃去上清液，得到肿瘤细胞沉淀。

细胞培养

接种：用适量的培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度，一般为 1×10⁵ - 1×10⁶个 /mL。将细胞悬液接种到培养瓶或培养皿中，轻轻摇匀，使细胞均匀分布。然后将培养瓶或培养皿放入二氧化碳培养箱中，在 37℃、5% CO₂的条件下培养。

换液：培养过程中，细胞会消耗培养基中的营养物质，并产生代谢废物。因此，需要定期更换培养基，以维持细胞的生长环境。一般每隔 1 - 2 天观察细胞生长情况并更换培养基。当细胞生长至汇合度达到 80% - 90% 时，需要进行传代培养。

细胞传代

消化：吸去培养瓶中的旧培养基，用 PBS 缓冲液冲洗细胞 1 - 2 次，去除残留的培养基和血清。然后加入适量的消化液，覆盖细胞表面，在 37℃下消化 1 - 3 分钟。当在显微镜下观察到细胞变圆、间隙增大时，加入含有血清的培养基终止消化。

吹打与接种：用移液管轻轻吹打细胞，使细胞从培养瓶壁上脱落下来，形成细胞悬液。将细胞悬液转移到离心管中，离心，转速和时间与初次分离细胞时相同。弃去上清液，用适量的新鲜培养基重悬细胞，然后按照一定的比例将细胞接种到新的培养瓶中，继续培养。

细胞冻存与复苏

冻存：当细胞培养到一定数量时，为了长期保存细胞，需要进行冻存。将细胞消化成单细胞悬液，离心后弃去上清液，加入适量的冻存液（一般为含 10% DMSO、20% 胎牛血清的培养基），使细胞密度为 1×10⁶ - 1×10⁷个 /mL。将细胞悬液分装到冻存管中，密封好，然后按照一定的降温程序进行冻存，一般先在 4℃冰箱中放置 30 分钟，再放入 - 20℃冰箱中放置 1 - 2 小时，最后放入 - 80℃冰箱中过夜，次日转移到液氮中保存。

复苏：从液氮中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴锅中，轻轻摇晃，使其在 1 - 2 分钟内快速解冻。然后将细胞悬液转移到离心管中，加入适量的培养基，离心，弃去上清液，用新鲜培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。