如何掌握感受态细胞的原理和制备方法

实验目的】
    1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
    2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
    【实验原理】
    质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。
    在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。
    质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competentcell）。
    有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
    对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法"。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。
    电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1X108转化子/μgDNA，甚至1X109转化子/μgDNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。
    微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。
    【试剂与器材】
    <一>试剂
    1．LB液体培养基:参见附录
    每组配200mL,其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
    2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:
    配1LLB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右,加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml(Amp储存液一般为100mg/mL),倒平板，每皿倒约15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL50mg/mLX-gal和100μL0.1mol/LIPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。
    每组制备LB平板2个，LB/Amp平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。
    3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2gIPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。
    4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。
    5．1mol/LCaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。
    6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。
    7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。
    <二>器材
    1.37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等
    2.高速冷冻离心机
    3.微量移液器等
    <三>菌株
    大肠杆菌DH5α
    【操作方法】
    1、感受态细胞的制备（无菌操作）
    1）从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5α大菌落接种到3mLLB培养液中（2），37℃剧烈振荡（210-240r/min）培养过夜（3）。
    2）取1mL过夜培养物,接种到含100mLLB培养液的500mL锥瓶中，37℃剧烈振荡，直至培养液中细菌浓度达到OD600为0.375-0.4（4）
    3）培养物转入2只50mL离心管中，冰上放置10分钟，4,000r/min,4℃离心15分钟，弃上清（5）。
    4）将菌体悬浮于10～20mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液中,冰上放置20分钟(6)。
    5）4,000rpm,4℃,离心10分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在2ml0.1mol/LCaCl2溶液中（7）。若不立即进行转化实验，则进行第6步操作，反之，则进入转化操作。
    6）缓慢滴入甘油(灭菌)至终浓度为15％,轻柔混匀，将细菌分装成0.5ml/每管，立即液氮冷冻，转入-70℃冰箱储存，可在2个月内使用（8）。
    2、感受态细胞的转化
    1）设计好实验项目，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）；
    2）从-80℃冰箱中取出分装成0.5mL/每管的感受态细胞,置冰上5分钟或缓慢流水淋至刚好解冻（10），立即分装到预冷的1.5mL离心管中，每管体积参见上表，插入冰上待用；
    3）对转化管，加入连接产物DNA溶液，轻轻混匀；为保险起见，也可先加入一半的连接产物DNA溶液，轻轻混匀，剩下的一半置-20℃冰箱保存；
    4）冰上放置30分钟（11）；
    5）放入42℃水浴中，热激40秒（12）；
    6）迅速插入冰上，放置5分钟；
    7）对第1、2项，加入500μLLB培养基，其余加入250μLLB培养基,37℃震荡培养1小时（13）；
    8）对第1项，各取200μL直接用玻璃珠涂布于2个LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上；对第2项，分别取3、30和100μL细菌培养液，各加无菌水至150μL（不超过200μL）涂LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的目的是计算转化率）；对其余各项，分别各取一半涂布于LB/Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存（14）。倒置平板，37℃培养12-14小时。一般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌比无活性酶的细菌生长慢，故过夜培养后可见到毫米大小的阳性白色菌落而阴性的兰色菌落只有针尖大小（15）。
    9）挑取白色菌落进行鉴定（见下一个实验）。
    【注意事项与提示】
    （1）倒平板时应避免培养基温度过高，若温度过高，则加入的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表面及皿盖会形成大量冷凝水，易于造成污染及影响单菌落的形成。若用手掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个月，时间过长氨苄青霉素将会失效。加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好现用。
    （2）DH5α在平板上过夜生长后，可置冰箱中保存一个月左右；接种新鲜的菌落或菌液有利于细菌细胞的同步快速生长，从而使细菌群体在达到一定的OD值后（0.375）大部分细胞都处于感受态。
    （3）DH5α的生长需要氧气，剧烈振荡的目的是提高培养基的溶氧量以利于细菌的生长
    （4）达到细菌对数生长早、中期，需时约2.0~2.5小时，此步骤至为关键，若超过此阶段，则转化效率急剧下降。
    （5）低温操作的目的是使细胞不再生长，保持其感受态。
    （6）此步骤的目的是洗涤细胞。
    （7）此时细胞较脆，悬浮时动作要轻，可用移液枪轻轻吸打。
    （8）-70℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低。可用一已知标准及浓度的闭环质粒如pUC18/19鉴定感受态细胞的转化能力。
    （9）实验中一定要设计正负对照，如用无DNA转化物的感受态细菌铺板，若有菌落生长，说明其中抗生素浓度不够或感受态细胞已被污染。加样时速度要快，但要有条不紊，切勿加错！加完样用枪尖稍搅匀。第1项中所加连接产物的量可根据连接反应的终体积而定，一般加一半或2/3，其余置－20℃保存。
    （10）从-80℃冰箱中取出冷冻的指管后，也可用双手搓指管，利用掌心的温度解冻。解冻时间勿过长。
    （11）至少30min，可延长至1h左右。
    （12）掌握时间，过长会致死细胞。在许多实验方案中，热激时间设为90至120秒，目前已有实验证明如此长的热激时间是没有必要的，且会引起转化效率的下降。热激前加入相当于转化液体积1/10的DMSO可提高转化效率10倍左右，加入DMSO后请勿再剧烈振荡。
    （13）此步骤使得细菌恢复正常并让β-内酰氨酶基因表达。
    （14）此步骤可在实验出现错误后进行补救。
    （15）培养时间勿过长，以免卫星菌落的出现。很多因素都可以影响转化的效率，特别需要注意的有两点，一是制备感受态细胞时的OD值，二是所用试剂要分析纯以上，并用双蒸水或超纯水（如MiliQ）配制。
    【实验安排】
    实验前两天挑E.coli菌种在LB平板上划线，37℃培养过夜。实验前一天各组要将试剂准备好，包括培养基的消毒灭菌。下午临下课时从平板上挑新鲜的单菌落接种到3mL液体培养基中培养过夜。转化完毕，次日一早观察记录结果，并清理余下的菌种试剂等。
    【实验报告要求与思考题】
    1．制备感受态细胞和转化时，应特别注意哪些环节。
    2．转化效率的计算：转化效率是指每微克质粒DNA转化细胞产生的转化子数目，请列表表示你的转化结果并算出转化率（列出计算公式）。你所做实验的转化效率（正对照）是多少？如果过低（如低于104cfu/μgDNA），请分析可能的原因。需要注意的是，连接产物的转化效率是非常低的，为什么？
    3．若实验出现不正常的结果，请分析原因。
    附录：大肠杆菌的高效转化方法
    一、试剂
    TB溶液：1.512gPIPES，1.1025gCaCl2，9.31875gKCl，溶于水，以5NKOH调pH6.7，再加入5.44225gMnCl2，定容至500ml，0.22?m滤膜过滤灭菌，4℃保存。
    SOB培养基：Tryptone20g(OXOID公司)；Yeastextract5g(OXOID公司)；NaCl0.5g，加800ml双蒸水，加入250mmol/LKCl溶液10ml，用10mol/LNaOH调pH至7.0，定容至1,000ml，高压灭菌，4℃保存；使用前加入5ml经高压灭菌的2mol/LMgCl2溶液。
    SOC培养基：含20mmol/L葡萄糖的SOB培养基，SOB培养基高压灭菌后，降温至60℃或以下时，加入20ml经过滤除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4℃保存。
    DMSO
    二、方法
    （一）感受态细胞的制备
    1.将E.coliDH5α，涂布于LB(A-)培养基上，37℃过夜。
    2.挑取2-3个直径2-3mm的大菌落，接种到50mlSOB培养基中。在250ml三角瓶中18℃，200-250rpm振荡培养，直到OD=0.6，约需要36-48hr。
    3.将三角瓶冰浴10分钟。
    4.转移菌液到50ml离心管。2,500g，10min，4℃。
    5.菌体用16ml冰预冷的TB溶液悬浮，冰浴10min。
    6.2,500g，10min，4℃。
    7.菌体用4ml冰预冷的TB溶液悬浮，加入280ulDMSO。
    8.菌液于冰浴10分钟后分装到冻存管。每管200ul。液氮冷却，保存于液氮中。大月0分钟后，转移到-40℃冰箱保存。
    （二）转化
    1.将LB抗性平板，SOC培养基，于37℃预热。
    2.室温溶解感受态细胞。
    3.取200uL菌液加入1.5mL离心管中，放于冰中。
    4.加入1-5uL质粒溶液，用枪头混匀，冰浴30min。
    5.42℃热激30秒，冰浴。
    6.加入800uLSOC培养基，37℃，250r/min，1hr。
    7.涂布LB抗性平板，37℃过夜。