原代细胞实验操作过程

培养信息：

包被条件PLL（0.1mg/ml）或明胶（0.1%）

培养基含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率每2-3天换液一次

生长特性贴壁

细胞形态内皮细胞样

传代特性可传1-2代；不建议多次传代

消化液0.25%胰蛋白酶

培养条件气相：空气，95%；CO2，5%

兔外周血来源内皮祖细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

发货时发送细胞电子版照片

三、使用方法

人外周血淋巴细胞是一种悬浮细胞，细胞形态呈圆形，在技术部标准操作流程下，细胞不增殖；不传代；建议您收到细胞后尽快进行相关实验。

客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1. 取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2. 悬浮细胞处理

1）收集T25细胞培养瓶中的培养基至50mL离心管中，用PBS清洗细胞培养瓶1-2次，收集清洗液；

2）1200-1500rpm离心3min，弃上清，收集细胞沉淀；

3）加入5mL新鲜培养基，用吸管轻轻吹打混匀、分散细胞；将分散好的细胞调整合适密度接种至培养器皿中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4）若遇到悬浮细胞团块较大，无法机械吹散时，向步骤2）中细胞沉淀添加0.25%胰蛋白酶消化液2mL至离心管中，用吸-管轻轻吹打混匀，37℃温浴2-3min，消化结束后，加入胰

酶抑制剂(或血清）终止消化，用吸管轻轻吹打，分散细胞；1200rpm离心5min，弃上清，

收集细胞沉淀；

5）加入5mL新鲜培养基，用吸管轻轻吹打混匀；按传代比例进行接种传代，然后补充新鲜的培养基至5mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

6）待细胞状态稳定后，培养观察，用于实验；之后再按照换液频率更换新鲜的培养基。

四、注意事项

1. 培养基于4℃条件下可保存3个月。

2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

3. 消化过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

4. 建议客户收到细胞后前3天每个倍数各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和技术部沟通；由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，详尽告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪、回访直至问题得到解决。

5. 该细胞只可用于科研。

特殊注意事项

6. 此细胞为悬浮细胞，请注意不要直接倒掉，造成损失；悬浮细胞因多数胞体较小，离心收集时，请注意悬液中细胞是否收集，可适当加大离心转速200转或增加离心时间3-5min，增加细胞获取量。

备注：由于实验所用试剂、操作环境及操作手法的不同，以上方法仅供各实验室参考